Nat Commun | 北京大学吕万良等开发一种蛋白酶可切割脂质体用于癌症免疫治疗

结肠癌是一种源自大肠结肠部分的癌症，也被称为肠癌或直肠结肠癌。虽然在发达国家，通过手术可以治愈局限于结肠内的癌症，但对于广泛扩散的晚期结肠癌，治愈率很低，五年生存率仅约三分之一。目前结肠癌的治疗主要包括手术、放疗和化疗，但效果有限。近年来，程序性死亡受体1(PD-1)或其配体(PD-L1)的免疫检查点阻断疗法在治疗晚期恶性肿瘤方面取得了显著进展，使部分患者获得长期缓解。研究表明，PD-L1在结直肠肿瘤组织中的表达率高达89%，而在正常人体组织细胞中仅为5%，这为免疫检查点阻断疗法提供了特殊优势。然而，临床分析显示，仅少数结肠癌患者对这种疗法有反应。

免疫疗效有限的原因可能与免疫抵抗有关，其中具有熟练错配修复(pMMR)和微卫星稳定性(MSS)的结直肠癌可能处于"冷"状态，如免疫细胞激活不足、原发性免疫功能障碍和/或免疫细胞的不可逆消耗。此外，PD-1或PD-L1抗体在注射后分布于全身，部分抗体可能被血液循环中的单核吞噬系统(MPS)清除，且抗体难以渗透到实体癌中，导致抗体递送效率降低。因此，如何克服免疫不足和向结直肠癌递送治疗抗体，成为亟待解决的关键科学问题。

近期，北京大学吕万良等在Nature Communications期刊上发表了题为A protease-cleavable liposome for co-delivery of anti-PD-L1 and doxorubicin for colon cancer therapy in mice的研究论文，该研究开发了一种新型蛋白酶可切割脂质体，不仅可作为免疫检查点阻断抗体的高效递送载体，还能作为免疫化疗的多功能平台治疗结肠癌。该脂质体通过合理设计的功能材料，利用结肠癌中丰富表达的半胱氨酸蛋白酶，实现在肿瘤部位的特异性切割，同时递送抗PD-L1抗体和化疗药物阿霉素，大大增强了免疫检查点阻断疗法的效果。

1) 研究团队合成了一种特异性的蛋白酶可切割抗PD-L1抗体脂质体(eLipo anti-PD-L1)，并可同时递送抗癌药物阿霉素(eLipo anti-PD-L1 dox)，以增强结肠癌的化学免疫疗法。脂质体由新合成的功能材料构成，包括癌症归巢肽(CHP)、肿瘤位点特异性蛋白酶可切割肽(AAN)和长循环脂质体膜材料，抗PD-L1抗体与脂质体共轭，阿霉素则被包封在脂质体囊泡内。

2) 体内实验证明，eLipo anti-PD-L1在结肠癌部位被半胱氨酸蛋白酶(legumain)切割成两部分：聚乙二醇化的抗PD-L1部分和归巢癌症的阿霉素脂质体部分。功能评估显示该脂质体具有靶向癌症、响应半胱氨酸蛋白酶、肿瘤渗透和免疫激活等效果，以及在体内治疗结肠癌小鼠的有效性。研究还验证了人结直肠癌组织中PD-L1和半胱氨酸蛋白酶的表达，表明该技术具有潜在的临床转化价值。

图1 蛋白酶可切割材料的合理设计和合成

3) 靶向分布和深度渗透能力实验表明，eLipo anti-PD-L1能在正交结肠癌小鼠模型中显著积累在肿瘤部位，且在癌细胞球体中展现强大的渗透能力。荧光共振能量转移(FRET)分析证实了抗PD-L1与PD-L1蛋白在结肠癌CT-26细胞和T细胞共培养系统中的结合相互作用。深入研究还发现，这种脂质体能被结肠癌细胞靶向内吞。

4) 机制分析表明，eLipo anti-PD-L1通过阻断CD8+ T细胞上的PD1与癌细胞上的PD-L1结合，从而激活CD8+ T细胞的免疫杀伤效应。转录组测序分析发现，eLipo anti-PD-L1导致CD8+ T细胞中1004个基因表达差异，特别是上调了与免疫激活相关的基因(如Cd14、Tnfrsf1b、Tapbp等)。基因本体论(GO)富集分析显示，这些基因主要参与促进干扰素-γ产生、增强T细胞分化、激活免疫应答等过程。

图2 蛋白酶可切割脂质体的工程和表征

5) 在结肠癌小鼠模型中，eLipo anti-PD-L1显著增加了肿瘤组织中成熟树突状细胞(CD80+CD86+细胞)、细胞毒性T淋巴细胞(CD8+ T细胞)和调节性T淋巴细胞(CD4+FOXP3+ T细胞)的百分比，并增强了CTLs与Treg细胞的比例。此外，它还提高了脾脏中CD8+ T细胞的百分比，促进了CD8+ T淋巴细胞中TNF-α和IFN-γ的表达，同时恢复了耗竭的T淋巴细胞(PD1HiCD8+ T淋巴细胞)的功能。

6) 治疗效果研究表明，单独使用eLipo anti-PD-L1就能显著抑制肿瘤生长，而联合递送阿霉素(eLipo anti-PD-L1 dox)进一步增强了疗效，明显延长了结肠癌小鼠的生存期。安全性评估显示，与其他对照组相比，eLipo anti-PD-L1和eLipo anti-PD-L1 dox不影响体重，也不影响天冬氨酸氨基转移酶(AST)和白蛋白(ALB)等血液生化指标，表明这些制剂对静脉注射是安全的。

图3 PD-L1 和legumain在人结直肠癌及其邻近组织中的表达

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